John Malkovich, 9 Aralık 1953 tarihinde ABD, Illinois'de doğmuştur. Tam adı John Gavin Malkovich'dir. Annesi Joe Anne eon Malkovich'dir. Baba tarafından dedesi Hırvat'dır. Lisede atletizm ile ilgilendi. Eastern Illinois Üniversitesi'nde okumuştur.

1976 yılında Chicago Steppenwolf Tiyatrosuna katılmak için üniversiteden ayrıldı. Arkadaşı Gary Sinise ile Şikago'da Steppenwolf Tiyatrosunun kuruluşuna yardım etti. Yedi yıl sonra Sam Shepard'ın 'True West' oyunuyla Obie ödülü kazandı. Daha sonra Dustin Hoffman ile birlikte oynadığı Arthur Miller'ın 'Death of a Salesman' oyununu canlandırdı. Aynı eserin 1985 yılında çekilen televizyon uyarlamasındaki performansıyla Emmy ödülü kazandı.
1984 yılında 'Places in the Heart' filminde bir körü canlandırdı ve Akademi Ödülüne aday gösterildi. Aynı yıl 'The Killing Fields'de başrol oynadı ve asıl büyük çıkışını 'Dangerous Liaisons' filmindeki Vicomte de Valmont karakteriyle yaptı. Clint Eastwood'un 'In the Line of Fire'ında cani bir suikastçi, Joseph Conrad'ın 'Heart of Darkness' romanının televizyon uyarlamasında ise modern dünyadan vahşi doğasına kaçan albay Kurtz karakterlerini canlandırdı. 'The Portrait of a Lady', 'Mary Reilly' gibi seçkin filmlerde ve kendisini canlandırdığı Spike Jonze filmi 'Being John Malkovich'deki performanslarıyla sinema dünyasının en büyük oyuncularından birisi olduğunu kanıtlayan Malkovich, tüm karakterlere yüklediği soğuk ve itici havasıyla tanınır.

John Malkovich, 2 Ağustos1982 tarihinde Glenne Headly ile evlendi. 1 Ocak1988 tarihinde boşandı.

John Malkovich, 20 Eylül 1989 tarihinde Nicoletta Peyran ile evlendi. Amandine Malkovich (d.1990), Lowry Malkovich (d.1992) adlarında iki çocuğu vardır.

John Malkovich, 1993 – 2003 yılları arasında 10 yıl Fransa'da yaşadı.

2011 yılında yapımcılığını Steven Spielberg, yönetmenliğini Michael Bay'ın yaptığı "Transformers: Ayın Karanlık Yüzü" adlı sinema filminde Bruce karakterini canlandırırken, Shia LaBeouf, Josh Duhamel, Rosie Huntington-Whiteley, Tyrese Gibson, Patrick Dempsey ile birlikte oynadı.